Drug-Delivery

V01

Funktionalisierung mineralisierter Kollagen Scaffolds mit Hypoxiekonditioniertem Medium (HCM) mit dem Ziel der beschleunigten Knochendefektheilung durch Stimulation der Angiogenese

*M. Quade¹, S. Duin¹, S. Knaack¹, A. Gabrielyan², A. Lode¹, A. Rösen-Wolff², M. Gelinsky¹

¹Universitätsklinikum Carl Gustav Carus und Medizinische Fakultät, Technische Universität Dresden, Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung (TFO), Dresden, Deutschland

²Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin, Dresden, Deutschland

Einleitung:

Der Einsatz des Tissue Engineering für die Regeneration großer Knochendefekte wird noch immer limitiert durch die initial fehlende Vaskularisierung und die damit verbundene inadäquate Nährstoff- und Sauerstoffversorgung der Zellen im Inneren solcher Konstrukte. Demnach werden Strategien benötigt, die sowohl die Angiogenese stimulieren als auch Zellen mit regenerativem Potential anregen, in den implantierten Scaffold einzuwandern (Konzept des in situ Tissue Engineering). Ziel der Untersuchungen war es, entsprechend funktionalisierte Scaffolds für die beschleunigte Knochendefektheilung zu entwickeln. Hierfür wurden die biologischen Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark genutzt, unter hypoxischen Bedingungen parakrine Wachstumsfaktoren zu sekretieren,¹ um ein angiogen und chemotaktisch wirkendes Wachstumsfaktorgemisch zu generieren. Hypoxie-konditioniertes Medium (HCM) in Kombination mit einem Hydrogel-Depot im Zentrum eines Scaffolds aus mineralisiertem Kollagen sollte durch eine kontrollierte Wachstumsfaktorfreisetzung und die damit verbundene Gradientenausbildung im Scaffold die Migration von Endothelzellen und Stammzellen in das Scaffoldinnere und auch die Angiogenese stimulieren.

Materialien und Methoden:

Die mineralisierten Kollagen-Scaffolds wurden durch Gefriertrocknung und anschließende chemische EDC-Quervernetzung hergestellt.² Für die HCM-Herstellung wurden aus Knochenmark isolierte humane mesenchymale Stromazellen (hBMSC) in Alpha-Medium (10vol-% fötales Kälber Serum, 10mM L-Glutamin und 500U/mL Penicillin/Streptomycin) unter normoxischen Bedingungen kultiviert. Bei einer Konfluenz von 80-90% wurde das Medium durch frisches Medium (verschiedene Zusammensetzungen wurden getestet) ersetzt und die Zellen für 48h unter hypoxischen Bedingungen kultiviert (1% O₂, 5% CO₂ bei 37°C).¹ Das so gewonnene HCM wurde mittels in vitro Angiogenese-Assays und VEGF-ELISA charakterisiert und anschließend in aufkonzentrierter Form mit Alginat bzw. Heparin-versetztem Alginat gemischt und als Hydrogel-Depot in das Zentrum der Scaffolds injiziert. Eine Cokultur aus hBMSC und HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) wurde auf die Oberfläche der funktionalisierten Scaffolds aufgebracht und das Einwachsen prävaskulärer Strukturen (Anzahl und Einwachstiefe) zu verschiedenen Kultivierungszeitpunkten fluoreszenzmikroskopisch untersucht.

Ergebniss und Diskussion:

Die fluoreszenzmikroskopische Analyse der in vitro Angiogenese Assays zeigte, dass HCM die Bildung prävaskulärer Strukturen ebenso potent stimuliert, wie die Zugabe von 20 ng/mL VEGF in der Kontrollgruppe. Durch Variation der Depotzusammensetzung konnten unterschiedliche Freisetzungsprofile für den Modell-Wachstumsfaktor VEGF erzielt werden, wobei die biologische Aktivität des freigesetzten VEGF vollständig erhalten blieb. Durch graduelle Freisetzung des injizierten Wachstumsfaktorgemisches aus dem Depot konnten prävaskuläre Strukturen tiefer in die poröse Scaffold-Struktur einwachsen als in unmodifizierte Scaffolds. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Hypoxie-konditionierte Zellkulturüberstände eine potentielle Alternative zu rekombinanten Wachstumsfaktoren darstellen, um die Migration von hBMSC und HUVEC ebenso anzuregen wie die Angiogenese. Die Injektion von HCM in mineralisierte Kollagen Scaffolds in Form eines zentralen Depots, ist demnach eine geeignete Strategie, um das Einwachsen von vaskulären Strukturen zu stimulieren und die Knochendefektheilung zu beschleunigen.

Danksagung

Diese Arbeit wurde von der Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert (SFB/Transregio 79).

Referenzen

1 Gabrielyan A. et al. BMC Veterinary Research 10, 1, 2014.

2 Gelinsky M. et al. Chem Eng J. 137, 84, 2008.

V02

Getriggerte Freisetzung von Wirkstoffen aus polymeren Nanopartikeln und Beschichtungen

*H. Menzel¹, C. Tolle¹, N. Poth¹, J. Riedel², D. Wirth², W. Dempwolf¹

¹Technische Universität Braunschweig, Institut für Technische Chemie, Braunschweig, Deutschland

²Helmholz-Zentrum für Infektionsforschung , Braunschweig, Deutschland

Einleitung:

Implantate können durch eine Modifikation der Oberfläche, die mit dem umliegenden Gewebe interagiert, verbessert werden. So lässt sich ein besseres Einwachsen in den Knochen durch die Gabe von Wachstumsfaktoren fördern. Weitere sehr wichtige Aspekte sind die Adhäsion von Bakterien und die Ausbildung von Biofilmen auf den für Implantate verwenden Materialien. Diese können zu massiven Infektionen um die Implantate herum führen. Eine Freisetzung von antibakteriellen Wirkstoffen kann helfen solche Implantat-assoziierten Infektionen zu vermeiden. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Freisetzung durch die Infektion selber ausgelöst werden kann. Dann kann auch mit relativ geringen Wirkstoffmengen eine effektive Wirkung erzielt werden. Solche Freisetzungssysteme lassen sich mit Hilfe von polymeren Nanopartikeln realisieren. Hier soll aufgezeigt werden, welche Ansätze verwendet werden können, um eine durch die Infektion ausgelöste, spezifische Freisetzung von Wirkstoffen zu realisieren.

Materialien and Methoden:

Die Nanopartikel werden durch ionotrope Gelierung von Polykationen wie z.B. Chitosan (Chi) oder Polyanionen wie z.B. Alginat (Alg) mit entsprechenden multivalenten Gegenionen (Tripolyphosphat (TPP) bzw. Polylysin (Plys), Peptiden mit Lysinsequenzen) hergestellt. Die Nanopartikel haben wohl definierte Partikelgrößen und Zeta-Potentiale. Ihr Abbau kann in der Suspension mittels dynamischer Lichtstreuung verfolgt werden. Durch eine einfache Sprühtechnik können aus den Nanopartikelsuspensionen entsprechende Beschichtungen auf z.B. Titan hergestellt werden. Der Abbau dieser Schichten unter Enzymeinfluss kann durch Schichtdickenmessungen nachvollzogen werden.

Ergebniss und Diskussion:

Erste Freisetzungsexperimente wurden mit BMP2 und Interferon-beta durchgeführt. Chi-TPP Nanopartikel schließen BMP2 mit einer Effizienz von mehr als 90% ein. In-Vitro-Experimente zeigen, dass die Freisetzung des BMP2 sehr eng mit dem enzymatischen Abbau des Chitosans zusammenhängt. Für das Alg-Peptid-System wird ein Abbau nur dann beobachtet, wenn Enzyme zugegen sind, die die Linkersequenz spalten. Der Abbau kann also spezifisch z.B. durch Aggrecanase, ein Enzym dass bei Entzündungen im Gewebe gebildet wird, ausgelöst werden.

V03

Das Potential von Nanopartikeln für die Immunisierung gegen virale Infektionen

*V. Sokolova¹, A. M. Westendorf², J. Buer², K. Überla³, M. Epple¹

¹Universität Duisburg-Essen, Institut für Anorganische Chemie , Essen, Deutschland

²Universitätsklinikum Essen, Medizinische Mikrobiologie, Essen, Deutschland

³Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnber, Institut von Klinische und Molekulare Virologie, Erlangen, Deutschland

Einleitung:

Impfungen zählen zu den wirksamsten Strategien zur Bekämpfung und Kontrolle von Infektionskrankheiten. Jedoch gibt es immer noch viele infektiöse Erkrankungen, bei denen die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs schwierig ist. In den letzten zehn Jahren haben nanoskopische Systeme wie virus-like particles, Liposome, Polymere und anorganische Nanopartikel eine große Aufmerksamkeit als potenzielle Trägermaterialien, die mit Impfstoffen (Antigenen und Adjuvantien) beladen oder funktionalisiert werden können, auf sich gezogen.^[1] Partikuläre Impfstoffe sind ein flexibles System, um Immunantworten spezifisch zu induzieren sowie beide Wege des immunologischen Gedächtnisses zu aktivieren (Abbildung 1).

Materialien und Methoden:

Nanopartikel weisen gegenüber traditionellen Impfstoffen einige Vorteile auf: Die Größe der Nanopartikel kann gesteuert werden, um den Transport durch biologische Barrieren zu ermöglichen. Impfantigene können innerhalb der Nanopartikel vor der Biodegradation geschützt und gezielt dosiert werden. Nanopartikel können auf der Oberfläche mit spezifischen Biomolekülen funktionalisiert werden, um Zellen gezielt zu adressieren und dort Antigene lokal freizusetzen.[2-4]

Referenzen:

[1] V. Sokolova et. al., Biomaterials 31 (2010) 5627.

[2] T. Knuschke et. al., Journal of Immunology 12 (2013) 6221-3229.

[3] T. Knuschke et. al., Nanomedicine: NBM 10 (2014) 1787.

[4] V. Sokolova et. al., Journal of Materials Chemistry B, 2015, DOI: 10.1039/C5TB00618J.

Abbildung 1

V04

Superparamagnetische Eisennanopartikel (SPIONs) undtrifunktionale Betulinsäurederivate als drug delivery carrier fürAnwendungen in der Krebstherapie

*N. Friedrich¹, A. Michaelis¹, G. Jahreis², R. Paschke³, F. Natalio¹

¹Institut für Chemie, Anorganische Chemie, Halle, Deutschland

²Max Planck Institut, Enzymologie und Proteinfaltung, Halle, Deutschland

³Biozentrum, Halle, Deutschland

Einleitung:

Es hat sich gezeigt, dass dem Feld der Bionanotechnologie immer größere Aufmerksamkeit zu Teil wird. Die Nanostrukturen besitzen durch das Verhältnis ihrer geringen Größe zur großen Oberfläche viele Möglichkeiten verschiedene organische Liganden an die Oberfläche zu knüpfen. Die dabei entstehenden neuen Eigenschaften dieser hybriden Formen ermöglichen neue Anwendungen in allen medizinischen Bereichen, wie z.B. die Erhöhung der Hydrophilität von wasserunlöslichen Stoffen.

Materialien und Methoden:

Die Betulinsäure ist ein vielversprechendes Molekül und wurde bisher in verschiedenen medizinischen Feldern (Malariapharmazeutika, Entzündungshemmung) eingesetzt. Die Verwendung der Betulinsäure in der AIDS- und Krebsforschung ist gegenwärtig allerdings von größerem Interesse.

Ergebnisse und Diskussion:

Trotz ihres großen Potentials in den bisher bekannten medizinischen Anwendungen hindert die Hydrophobizität und Ungenauigkeit des targeting eine effiziente Anwendung in physiologischen Systemen. In dieser Arbeit präsentieren wir eine neue Methode zur Synthese von trifunktionalen Betulinsäurederivaten basierend auf der Strategie der Festphasenpeptidsynthese. Diese trifunktionalen Derivate können mit Hilfe von Dopamin und einem Polypeptidlinker kovalent an die Oberfläche der superparamagnetischen Eisennanopartikel (SPIONs) gebunden werden. Der Polypeptidlinker kann durch Auswahl der Aminosäuresequenz zusätzlich die Löslichkeit erhöhen. Seine Länge beeinflusst außerdem durch den Abstand des Nanopartikels zur Betulinsäure die intrinsische Funktion der Betulinsäure. Dieses Bionanosystem wird anschließend auf seine Wirksamkeit gegenüber Tumorzellen getestet. Dabei erhoffen wir uns die gleiche Wirkung (Aktivierung von Apoptose) wie in vorausgegangenen Arbeiten mit Betulinsäure5. Die Bereitstellung dieser Nanomaterialen soll zeigen, dass es möglich ist, bisher positiv getestete, allerdings nicht nutzbare Verbindungen tatsächlich nutzbar zu machen.

V05

Pharmakokinetic on a microscale: Understanding the Intracellular Nanoparticle Drug Delivery Pathways By combining Proteomics with molecular biology

*V. Mailänder¹, D. Hofmann¹

¹Universitätsmedizin Mainz, III. Medizinische Klinik, Mainz, Deutschland

Introduction:

Rational design of nanocarriers for drug delivery approaches requires an unbiased knowledge of uptake mechanisms and intracellular trafficking pathways. Ways to investigate these processes using a quantitative proteomics approach as well as molecular biology are discussed.

Materials and Methods:

Nanoparticle synthesis was done in the group of Prof. K. Landfester (superparamagnetic iron oxide nanoparticles with polystyrene as a biocompatible but not biodegradable formulation). After incubation with HeLa cells overnight we disrupted the cells mechanically, sorted magnetically and subjected the magnetic and non-magnetic fractions to proteomic mass spectrometry identification. Found proteins (about 1500, 800 enriched) were grouped by DAVID Ontology analysis. Molecular biology with GFP-tagging, overepression and expression of dominant negative proteins was used to validate the proteomic snapshot data and to gain further dynamic insight.

Results and Discussion:

Isolation of intracellular vesicles containing superparamagnetic iron oxide polystyrene nanoparticles and methods how to dissect their protein composition by label free quantitative mass spectrometry will be presented. As an example how this can yield new insights the proteomic snapshot of organelle marker proteins indicating an atypical macropinocytic-like mechanism used for the entry of nanoparticles is demonstrated. We show that the entry mechanism is controlled by actin reorganization, atypical macropinocytic signaling and ADP-ribosylation factor 1. Additionally, this proteomics approach demonstrated a central role for multivesicular bodies and multilamellar lysosomes in trafficking and final nanoparticle storage. This is confirmed by confocal microscopy and cryo-TEM measurements. By quantitatively analyzing the protein composition of nanoparticle-containing vesicles, we demonstrate a methodoloy how to clearly define the routes of nanoparticle entry, intracellular trafficking and the proteomic milieu of a nanoparticle-containing vesicle. Finally also the degradation process of proteins adsorbed to nanoparticles was visualized.

References:

1. Hofmann, D. et al. ACS Nano 8(10): p.10077-8 (2014)

2. Hofmann, D., et al., Chem Commun (Camb), 50(11): p. 1369-71 (2014)

V06

Stimulus-Responsive Hydrogel Vaccine Depots

R. Gübeli¹, *H. Wagner¹, B. Rebmann¹, D. Hövermann¹, W. Weber¹

¹Institut für Biologie II / BIOSS, AG Weber, Freiburg, Deutschland

Introduction:

Vaccination is one of the most powerful and effective preventive health measure to protect people from infectious diseases. However, most vaccines require boost injections leading to poor patient compliance and thus to a significant percentage of the population which is not well protected. Reducing the number of required medical consultations and hence simplification of the vaccination regime might be a promising approach to increase the global health.

Materials and Methods:

8-arm polyethylene glycol (PEG)-fluorescein was synthesized by reacting 8-arm PEG-amine (MW = 20 kDa) with fluorescein isothiocyanate (FITC). A fluorescein-specific single-chain variable fragment (scFv) was recombinantly produced in L-form cells of Proteus mirabilis L VI and purified by immobilized metal affinity chromatography. Hydrogels were formed by mixing 8-arm PEG-fluorescein with scFv and HPV vaccine cargo and adding vinylsulfone-functionalized 8-arm PEG (PEG-VS, MW = 40 kDa). The viscoelastic properties of the resulting hydrogels were determined by frequency-sweep experiments. Fluorescein-induced cargo release was quantified by Bradford method and additionally analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The cell culture compatibility of the hydrogel depots was determined and the immune response of mice vaccinated with the hydrogel depot was evaluated and compared to the classical prime-boost injection regime.

Results and Discussion:

We present a novel strategy to reduce repetitive vaccine injections using a biohybrid hydrogel depot that enables the timely controlled release of the boost vaccine in response to an orally available stimulus. To maximize safety and biocompatibility the hydrogel design was exclusively based on components routinely used in the clinics. The drug depot can be administered together with the primary vaccine dose thereby replacing subsequent injections with oral application of a trigger tablet. Vaccination of mice against the oncogenic human papilloma virus type 16 demonstrated the functionality and safety of our hydrogel depots mediating an immunoprotection equivalent to the classical multi-injection vaccination regime.[1] We propose that our hydrogel depot represents a rather generally applicable design for custom-tailored stimulus-responsiveness and patient compliant delivery of vaccines or even other cargo pharmaceuticals.

References:

[1] Raphael J. Gübeli, Desirée Hövermann, Hanna Seitz, Balder Rebmann, Ronald G. Schoenmakers, Martin Ehrbar, Ghislaine Charpin-El Hamri, Marie Daoud-El Baba, Martin Werner, Martin Müller, Wilfried Weber; Remote-Controlled Hydrogel Depots for Time-Scheduled Vaccination, Advanced Functional Materials, Vol 23, 5355 (2013)