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Engineering the genetic code of Escherichia coli with methionine analogues and bioorthogonal amino acids for protein immobilization
Simone, Alessandro de
Over the past decade, genetic encoding of non-canonical amino acids (ncAAs) into proteins has emerged as a powerful tool in protein engineering. Recent progresses focus mostly on the incorporation of two or more ncAAs by using stop codon suppression methodologies, but little work has been done to recode one or more sense codons.
The first part of this thesis describes follow up experiments to test whether an heterologous methionyl-tRNA synthetase (MetRS)/tRNAMet pair from an archeaon behaves orthogonal in Escherichia coli for the simultaneous incorporation of the methionine (Met) analogues azidohomoalanine (Aha) and ethionine (Eth) in response to the starting and internal sense codons, respectively. We determined that this was not the case. Therefore, other established orthogonal pairs were tested, of which the Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS) pair was found as the most promising candidate. Next, a new selection system based on amber stop codon suppression in the pfkA (phosphofructokinase I) gene was developed and optimized to screen an MmPylRS library. Upon screening, a mutant that was able to incorporate Met in response to stop codons was isolated. Further optimization of this system will allow the incorporation of Met analogues into targeted locations.
In the second part of this thesis, the site-specific incorporation of ncAAs by amber codon suppression was explored to generate multiple sites for protein bioconjugation and immobilization. The lipase from Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (TTL) was used as model protein because lipases are one of the most versatile biocatalysts employed in the industry. Two E. coli strains lacking release factor I (RF1) were evaluated for their suppression efficiencies at single and multiple amber codons in comparison with a standard expression strain. High incorporation of N-Propargyl-Lysine (Plk) was achieved at a specific permissive position on the TTL surface using a RF1-deficient strain, whereas suppression at multiple positions was suboptimal and dependent on the orthogonal pair, ncAA and expression vector employed. Incorporation of the ncAA Plk into TTL endowed the enzyme with an alkyne group for bioconjugation without impairing its activity. The alkyne group was then selectively and efficiently conjugated to azide-biotin via copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), with retention of enzymatic activity. Attempts to achieve direct immobilization of biotinyl-TTL on Strep-Tactin® beads as well as alkynyl-TTL on azide-agarose beads, although unsuccessful, provided some insights that will guide further optimization endeavors.
In summary, this work describes the first efforts towards the development of a genetic selection system for the reassignment of the Met sense N-terminal and internal codons to two different ncAAs in E. coli. It also provides insights into the potential use of site-specific incorporation of ncAAs into proteins and biocatalysts for applications such as bioconjugation and immobilization.
In den letzten zehn Jahren, der genetische Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAAs) ist als ein mächtiges Werkzeug in der Protein-Engineering entstanden. Jüngste Fortschritte konzentrieren hauptsächlich auf den Einbau von zwei oder mehr ncAAs durch Stop-Codon Suppression Methoden, aber wenig Arbeit gemacht wurde, um eine oder mehr Sense-Codons neu zu kodieren.
Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt Anschlussexperimenten zu prüfen, ob eine heterologe Methionyl-tRNA synthetase (MetRS)/tRNAMet Paar aus einem archeaon in Escherichia coli orthogonal verhält für den gleichzeitigen Einbau von Methionin (Met) Analoga azidohomoalanine (Aha) und Ethionin (Eth) in Reaktion auf das N-terminus und internen Sense-Codons, beziehungsweise. Deshalb andere bereits etablierte orthogonale Paare wurden als Rettungssysteme getestet, unter denen die Methanosarcina mazei Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (MmPylRS) ist die vielversprechendste. In diesem Zusammenhang, ein neues Selektionssystem auf Basis von Amber-S uppression im Gen pfkA (phosphofructokinase I) wurde entwickelt und optimiert, um eine MmPylRS Bibliothek zu screenen für eine Mutante die Methionin einbaut. Wir stellten fest, dass dies nicht der Fall war. Daher andere etablierte orthogonale Paare wurden getestet, von denen die Methanosarcina mazei Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (MmPylRS) Paar als die vielversprechendste Kandidat gefunden wurde. Als nächstes wurde ein neues Selektionssystem basiert auf amber-Codon Unterdrückung im pfkA (Phosphofructokinase I) stoppen essentielles Gen entwickelt und optimiert eine MmPylRS Bibliothek zu screenen. Beim Screening, eine Mutante, die Met in Reaktion auf übernehmen konnte Codons zu stoppen, wurde isoliert. Eine weitere Optimierung dieses Systems wird die Einarbeitung von Met-Analoga in Zielregionen ermöglichen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit, die ortsspezifischen Einbau von ncAAs durch Amber-Suppression wurde als nĂĽtzliche Technik erforscht, um mehrere Standorte fĂĽr Protein Biokonjugation und Immobilisierung zu erzeugen. Ein wichtiger industrieller Biokatalysator, die Lipase aus Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (TTL), wurde als Modellprotein verwendet.
Zwei Escherichia coli-Stämme, denen die release factor I (RF1) fehlt, wurden für ihre Suppressionseffizienzen bei einzelnen und mehreren Amber-Codons im Vergleich zu einem Standard-Expressionsstamm ausgewertet. Höheren Einbau von N-Propargyl-Lysine (Plk) an einer bestimmten permissive Position auf dem TTL Oberfläche unter Verwendung von einem RF1-defizienter Stamm wurde erreicht, während die Suppression an mehreren Positionen gezeigt war immer noch niedrig und abhängig von die benutzten orthogonales Paar, ncAA und Expressionsvektor.
Der Einbau von Plk in TTL hatte keinen Einfluss auf seine Aktivität und stattete das Enzym mit einem Alkin-Gruppe für Biokonjugation. Diese Gruppe wurde dann selektiv und effizient zu Azid-Biotin durch Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) konjugiert, unter Beibehaltung der enzymatischen Aktivität. Versuche, die Immobilisierung von Biotinyl-TTL auf Strep-Tactin® Resin und von Alkinyl-TTL direkt auf Azid-Agarose-Beads zu erreichen, obwohl erfolglos, halfen zu definieren, die Bedingungen die weitere Optimierung benötigen.
Zusammengefasst beschreibt diese Arbeit die ersten Bemühungen für die ressignment von Methionin in Translationsinitiations und Elongation zu zwei verschiedenen Analoga in Escherichia coli und stellt ein Beispiel für die mögliche Verwendung von ortsspezifischen Einbau von ncAAs für Protein Biokonjugation und Immobilisierung.
