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Raman Spectroelectrochemical Investigations of Immobilized Redox Proteins
Grochol, Jana
Das Interesse an auf Elektroden immobilisierten Redoxproteinen ist in den letzten Jahren stark gestiegen. Die oberflächenverstärkte Resonanz-Raman- (SERR) Spektroelektrochemie eignet sich hervorragend zum Studium des heterogenen Elektronentransfers, da sie selektiv das Schwingungsspektrum der Redoxzentren der immobilisierten Spezies abfragt. SERR Spektroskopie kombiniert die Vorteile der Oberflächen- und Resonanz-Verstärkung, indem Hämproteine auf rauen Silberelektroden adsorbiert und in der Soret-Absorptionsbande angeregt werden. Eine biokompatible Beschichtung der rauen Elektroden verhindert die Denaturierung des Proteins. Die vorliegende Arbeit analysiert die Mechanismen und die Dynamik des heterogenen Elektronentransfers des lösliches Cytochrom c (Cyt c) und der membrangebundenen Cytochrom c Oxidase (CcO). Zuerst wurde Cyt c an Pyridin-terminierte selbstorganisierte Monoschichten koordinativ gebunden und als Modellsystem untersucht. Elektronentransfer auf dünnen Monoschichten wurde mit zeitaufgelöster SERR Spektroskopie verfolgt. Der Anstieg der Elektronentransferrate mit zunehmender treibender Kraft wies auf eine Änderung des Mechanismus vom nonadiabatischen in großer Entfernung von der Elektrode zum verstärkt von Lösung/Protein-Dämpfung kontrollierten Prozess bei kurzen Abständen hin. Weiterhin wurden Polyelektrolyt-Cyt c Multilagen, die potenziell als Biosensoren angewendet werden können, untersucht. Ein anionischer Polyelektrolyt wurde alternierend mit dem kationischen Protein auf eine beschichtete Elektrode adsorbiert. Die Multilagen waren allerdings an Silberelektroden nicht stabil, so dass nur eine PASA-Cyt c Lage mit SERR Spektroelektrochemie und Zyklovoltammetrie erforscht werden konnte. Beide Methoden ergaben eine hervorragende Übereinstimmung der Redoxpotenziale und formalen Geschwindigkeitskonstanten. SERR Spektren wiesen darauf hin, dass Cyt c innerhalb des PASA-Systems im nativen Zustand vorliegt. Stationäre und zeitaufgelöste SERR Messungen zeigten reversible spektrale Änderungen des Polyelektrolyten, welche auf einen Elektronentransfer zwischen PASA und Cyt c hindeuten. Schließlich wurde eine neuartige Immobilisierungsstrategie eingesetzt, bei der man die membrangebundene CcO an die Elektrode adsorbiert und anschließend eine Lipid-Umgebung wiederherstellt. Die Immobilisierung basiert auf der Affinität einer chelatbildenden Elektrodenbeschichtung zum Histidin-Tag, der an zwei gegenüberliegenden C-Termini des Enzyms angebracht wurde. Daher kann diese Methode auf viele (Membran)Proteine ausgeweitet werden. Die schnell auftretende Photoreduktion im immobilisierten Zustand konnte erst mit einem neuen experimentellen Aufbau verhindert werden. SERR Spektren zeigten eine native Struktur der Häm a und Häm a3 Kofaktoren. Die Elektronentransfer Dynamik war unabhängig von der Orientierung des Enzyms und der treibenden Kraft, was auf einen "Hopping"-Mechanismus über 50 A hinweist. Die auf Häm a begrenzte elektrochemische Reduktion läßt eine Störung der nativen Kooperativität zwischen Elektronentransfer und Protonentranslokation vermuten, die möglicherweise durch das elektrische Feld induziert wird.
Redox proteins adsorbed on electrodes have gained increasing attention of researchers in both fundamental and applied science. Surface-enhanced resonance Raman (SERR) spectroelectrochemistry is a particularly suitable technique for studying heterogeneous electron transfer reactions as it selectively probes the redox sites of the adsorbed proteins. SERR spectroscopy combines the advantages of the surface and resonance enhancement by exciting a heme protein immobilized on rough silver electrodes in the Soret absorption band region. Protein immobilization methods involve coating the electrodes with biocompatible films in order to prevent protein denaturation. This work focuses on the elucidation of heterogeneous electron transfer mechanism and dynamics of the soluble cytochrome c (Cyt c) and the membrane-bound cytochrome c oxidase (CcO) attached to electrodes modified with different functional groups. First, Cyt c coordinatively attached to self-assembled monolayers of pyridine-terminated alkanethiols on electrodes was employed as a model system to study basic aspects of heterogeneous electron transfer. Electron transfer at short spacer lengths was monitored by time-resolved SERR spectroscopy. The electron transfer rate constant increased with increasing driving force indicating a change of mechanism from a nonadiabatic, tunneling controlled reaction at long distances to the electrode, to an increasingly solvent/protein friction controlled mechanism at shorter spacers. Second, polyelectrolyte-Cyt c multilayers were investigated, which are of interest in the fabrication of biosensors. An anionic polyelectrolyte, the poly(aniline sulfonic acid) (PASA), was used to intercalate the cationic redox protein. The PASA-Cyt c multilayer assemblies were, however, not stable on rough Ag electrodes coated with a mixed carboxyl/hydroxyl-terminated film resulting in a one PASA-Cyt c layer system. As indicated by SERR measurements, Cyt c within the PASA layer retains its native properties. Redox potentials and standard rate constants of the immobilized Cyt c determined by SERR spectroelectrochemistry display an excellent agreement with the values obtained by cyclic voltammetry. Stationary and time-resolved SERR experiments reveal reversible spectral changes of PASA that provide evidence for electron exchange between Cyt c and PASA pointing to a tight coupling of the two species in the multilayer assemblies. Finally, a novel immobilization technique was employed to attach CcO to an electrode and subsequently reconstitute the lipid environment. The immobilization procedure is based on the affinity of a metal-chelating surface modification to a histidine-tag, engineered to different sides of the enzyme, and hence is applicable to a large variety of (membrane) proteins. Upon avoiding the very facile photoreduction, SERR spectra of the immobilized CcO reveal preservation of the native structures of the heme a and heme a3 sites. The electron transfer reaction was independent of enzyme orientation and the applied driving force suggesting that it involves multi-step electron tunneling or hopping over a distance of ca. 50 A. Moreover, electrochemical reduction was restricted to heme a pointing to a perturbation of the native network of cooperativities between electron transfer and proton translocation in the immobilized enzyme.
