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Abstract

Circulating tumor cells (CTCs) are cancerous cells that shed from a primary tumor, intravasate into blood, travel through the blood circulation, and then extravasate to distant organs and form secondary tumors. Hence, CTCs are critical to understand the biological process of metastasis and could serve as potential blood-based surrogate markers to noninvasively evaluate tumor progression and response to treatment. Although isolation of CTCs from pancreatic adenocarcinoma (PDAC) patients is feasible, investigating their clinical utility has proven less successful than in other cancers due to limitations of epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM)-only based CTC assays. We developed a "Carpet Chip” using sequential immunoaffinity-based microfluidics to study the biological relevance of heterogeneous CTCs. Both epithelial (EpCs) and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)-like CTCs (EMTCs) were detected from the blood of PDAC patients (n=35). Thirty-four patients had ≥5 EpCs mL−1 and 35 patients had ≥15 EMTCs mL−1. Overall, significantly higher numbers of EMTCs than EpCs were recovered, reflecting the aggressive nature of PDAC. Furthermore, higher numbers of EMTCs were observed in patients with lymph node involvement compared to patients without. Gene expression profiling of CTCs from 17 patients revealed that CXCR1 is significantly upregulated in EpCs, while known stem cell markers POU5F1, or Oct-4 and MYC were upregulated in EMTCs. Thus, successful isolation and genomic profiling of heterogeneous CTC populations were demonstrated, revealing genetic signatures relevant to patient outcomes. Individualizing therapies targeting genes involved in EMT could reduce metastasis and improve patient survival. In further studies on PDAC patients, the utility of CTCs as a tool was validated for assessing tumor response to the only three therapy options currently available: surgery, chemotherapy, and radiotherapy. For all treatment options, we observed a statistically significant decrease in CTC counts after treatment completion, which was associated with prolonged OS. Orthogonally, in an effort to develop label-free technologies for CTC isolation, a microfluidic Labyrinth device for high throughput, label-free, size-based isolation of CTCs was applied to study CTCs from metastatic non-small cell lung cancer patients (NSCLC). Current methods for isolation of lung CTCs mostly rely on biomarker dependent antibody-based capture, missing populations that may be stem-like in nature. Using Labyrinth operating at a flow rate of 2.5 mL/min, heterogeneous CTC populations were isolated from NSCLC patients (n=21). Detected populations included CTCs (PanCK+ and CD45-), CTCs expressing EpCAM or Vimentin, and CTCs expressing both markers representing an EMT-like population of CTCs. We were able to isolate CTCs from 100% of patients with an average yield of 180±168 CTCs mL-1. Among captured CTCs, EpCAM- CTCs were significantly more common than EpCAM+ CTCs (115.7 vs. 39.1 CTCs mL-1 respectively). Cell clusters of 2 or more CTCs were also observed in 95% of patients; 79% of these clusters were negative for EpCAM expression, whereas 35% expressed Vimentin, suggestive of an EMT phenotype. Recovered CTCs from patients with RET, ROS1 and ALK rearrangements in tumors showed aberrations matching the primary tumor for each gene using FISH analysis. We successfully expanded CTCs in vitro and the cultured cells carried matched mutations. The Labyrinth device demonstrated the advantages of marker-independent separation methods for isolation of heterogonous CTC sub-populations in lung cancer for CTC expansion, allowing drug testing for therapies targeting specific driver mutations. The capability of collecting recovered CTCs from the device using a continuous processing technique opens up opportunities for not only CTC expansion off-chip, but also ex-vivo drug testing to direct patient-specific therapies.

Translation of abstract (German)

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind Krebszellen, die aus einem Primärtumor ausgeschieden werden, sich in Blut intravasieren, durch den Blutkreislauf wandern und dann in entfernte Organe extravasieren und sekundäre Tumore bilden. Daher sind CTCs für das Verständnis des biologischen Prozesses der Metastasierung von entscheidender Bedeutung und könnten als mögliche Ersatzmarker auf Blutbasis dienen, um die Tumorprogression und das Ansprechen auf die Behandlung nicht-invasiv zu bewerten. Obwohl die Isolierung von CTCs aus Patienten mit Pankreasadenokarzinom (PDAC) durchführbar ist, hat sich die Untersuchung ihres klinischen Nutzens aufgrund von Einschränkungen der nur auf EpCAM-basierenden CTC-Tests auf Epithelzellen (EpCAM) basierenden Tests als weniger erfolgreich erwiesen. Wir entwickelten einen "Carpet-Chip" mit sequenziellen Mikrofluidik auf Immunoaffinitätsbasis, um die biologische Relevanz heterogener CTCs zu untersuchen. Sowohl epitheliale (EpCs) als auch epithelial-mesenchymale Übergangs (EMT) -ähnliche CTCs (EMTCs) wurden aus dem Blut von PDAC Patienten (n = 35) detektiert. Vierunddreißig Patienten hatten ≥5 EpCs mL-1 und 35 Patienten hatten ≥15 EMTCs mL-1. Insgesamt wurden deutlich mehr EMTCs als EpCs gewonnen, was die Aggressivität von PDAC widerspiegelt. Darüber hinaus wurden bei Patienten mit Lymphknotenbefall im Vergleich zu Patienten ohne EMTC eine höhere Anzahl von EMTCs beobachtet. Genexpressionsprofile von CTCs von 17 Patienten zeigten, dass CXCR1 in EpCs signifikant hochreguliert ist, während bekannte Stammzellmarker POU5F1 oder Oct-4 und MYC in EMTCs hochreguliert wurden. So wurde die erfolgreiche Isolierung und das genomische Profiling heterogener CTC-Populationen demonstriert, was genetische Signaturen aufzeigt, die für die Patientenergebnisse relevant sind. Durch die Individualisierung von Therapien, die auf Gene abzielen, die an der EMT beteiligt sind, könnte die Metastasierung verringert und das Überleben der Patienten verbessert werden. In weiteren Studien an PDAC-Patienten wurde der Nutzen von CTCs als Instrument für die Bewertung der Tumorreaktion auf die drei derzeit verfügbaren Therapiemöglichkeiten validiert: Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie. Bei allen Behandlungsoptionen beobachteten wir eine statistisch signifikante Abnahme der CTC-Werte nach Abschluss der Behandlung, die mit einem verlängerten OS verbunden war. In dem Bestreben, kennzeichnungsfreie Technologien für die CTC-Isolierung zu entwickeln, wurde orthogonal ein mikrofluidisches Labyrinth-Gerät für die markierungsfreie, größenbasierte Isolierung von CTCs mit hohem Durchsatz angewendet, um CTCs von Patienten mit metastasiertem nicht kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) zu untersuchen . Derzeitige Methoden zur Isolierung von Lungen-CTCs basieren meistens auf Biomarker-abhängiger Erfassung von Antikörpern, wobei Populationen fehlen, die möglicherweise stammähnlich sind. Unter Verwendung von Labyrinthbetrieb, das mit einer Flussrate von 2,5 ml / min betrieben wurde, wurden heterogene CTC-Populationen aus NSCLC-Patienten (n = 21) isoliert. Zu den entdeckten Populationen gehörten CTCs (PanCK + und CD45-), CTCs, die EpCAM oder Vimentin exprimieren, und CTCs, die beide Marker exprimieren, die eine EMT-ähnliche Population von CTCs darstellen. Wir konnten CTCs von 100% der Patienten mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 180 ± 168 CTCsmL-1 isolieren. Unter den erfassten CTCs waren EpCAM-CTCs signifikant häufiger als EpCAM + CTCs (115,7 vs. 39,1 CTCsmL-1). Bei 95% der Patienten wurden auch Zellcluster von 2 oder mehr CTCs beobachtet. 79% dieser Cluster waren für die EpCAM-Expression negativ, während 35% Vimentin exprimierten, was auf einen EMT-Phänotyp hindeutet. Wiederhergestellte CTCs von Patienten mit RET-, ROS1- und ALK-Umlagerungen in Tumoren zeigten unter Verwendung der FISH-Analyse für jedes Gen Abbildungsfehler, die mit dem Primärtumor übereinstimmen. Wir konnten CTCs in vitro erfolgreich ausbauen und die kultivierten Zellen übereinstimmende Mutationen tragen. Die Labyrinth-Vorrichtung demonstrierte die Vorteile von markerunabhängigen Trennungsverfahren für heterogonale CTC-Subpopulationen in einer CGD für die CTC-Dilatation, wodurch Medikamententests für Therapien durchgeführt werden können, die auf spezifische Treibermutationen abzielen. Die Möglichkeit, gewonnene CTCs mithilfe einer kontinuierlichen Verarbeitungstechnik vom Gerät zu sammeln, eröffnet nicht nur Möglichkeiten für die CTC-Erweiterung außerhalb des Chips, sondern auch Ex-vivo-Drogentests, um patientenspezifische Therapien zu steuern.